測定植物體內(nèi)游離氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。

【原理】

游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，其顏色的深淺與游離氨基酸的含量成正比。

【儀器設(shè)備】

分光光度計；電子天平；容量瓶25ml或50ml 3個；漏斗（直徑6厘米）3個、濾紙適量；20ml刻度試管 7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；試管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封試管口）；吸水紙；擦鏡紙適量；電爐；水浴鍋（含鐵絲筐）。

【試劑】

    1．3%茚三酮試劑  稱3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里，貯于棕色瓶中。此試劑應(yīng)放在冷涼處，不宜久放，使用期約10天。

2．氰酸鹽緩沖液（按以下方法配制）：

（1）NaCN貯備液0.01mol/L（490mg/L）。

（2）醋酸緩沖液：稱360g醋酸鈉（含三分子結(jié)晶水）溶于約300ml無氨蒸餾水中，加66.67ml冰醋酸再用無氨蒸餾水稀釋至1L。

取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。

3．標(biāo)準(zhǔn)氨基酸  稱取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg（或α-丙氨酸8.9mg）溶于10%的異丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%異丙醇稀釋至刻度，混勻，即為1mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸貯備液，置冰箱中保存。為了制備工作液，可取貯備液與等量無氨蒸餾水混合，此液濃度為0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5μmol，或氨基氮7μg。

4．95%乙醇；5．異丙醇（分析純）。

【操作步驟】

    1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作  取20ml刻度試管18支，按下表15-1加入各試劑。加完試劑后混勻，在100℃水浴中加熱12min（加熱時封口），取出在冷水中迅速冷卻，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，使加熱時形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色，此時溶液呈藍(lán)紫色。于570nm波長下測其光密度（以空白管為參比），以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。

表15-1  各試管加入試劑量

2．樣品提取  選取有代表性的植物葉片（或其它組織），洗凈擦干，剪碎混勻，迅速稱取0.10～0.20g（視氨基酸含量多少而定），共稱3份，分別加入20ml刻度試管中，再加蒸餾水10ml蓋塞（或系上塑料薄膜），置沸水浴中20min以提取游離氨基酸，到時取出在自來水中冷卻，把上清液濾入25ml容量瓶中，之后再往試管中加5ml蒸餾水，置沸水浴上再加熱10min，過濾并反復(fù)沖洗殘渣，zui后定容至刻度，搖勻。

3．樣品測定  另取4支潔凈干燥的試管，其中3支分別加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸餾水，然后在上述4支試管中分別加入NaCN緩沖液、水合茚三酮各0.5ml，加完試劑后蓋塞，置沸水浴上加熱12min，冷卻后，再分別加5ml 95%乙醇，搖勻，以空白作參比，在波長570nm下測其光密度。

根據(jù)光密度查標(biāo)準(zhǔn)曲線（或用回歸方程計算）即可求出提取液中氨基酸的濃度。

4．計算  游離氨基酸含量（NH₂ －Nμg / g FW）＝

式中  C－由直線方程計算的值，即0.5ml試樣中氨基酸的微摩爾數(shù)（_μmol）；

V－樣品提取液經(jīng)稀釋后的總體積（ml）；

W－樣品重（g）。

測定結(jié)果按表15-2記錄。

表15-2 游離氨基酸總量測定記載表      測定日期：