基因擴(kuò)增-簡要概述 

Myc基因擴(kuò)增形成雙微核（黃色）的核型
細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制DNA,產(chǎn)生大量的拷貝。如兩棲類卵母細(xì)胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴(kuò)增到1000多倍。基因擴(kuò)增是通過形成幾千個(gè)核進(jìn)行的，每個(gè)核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，zui后卵母細(xì)胞中的這些rRNA基因的拷貝數(shù)幾乎達(dá)到50萬個(gè)，而在相同生物的其它類型細(xì)胞中，這些rRNA基因的拷貝數(shù)只有幾百個(gè)。卵母細(xì)胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過程中合成大量核糖體創(chuàng)造了條件。
至于卵母細(xì)胞中rRNA的機(jī)制，有人認(rèn)為可能是通過從染色體上分離出來的環(huán)狀DNA分子，這種環(huán)狀DNA中含有rRNA基因，但是*個(gè)含有rRNA基因的環(huán)狀DNA是如何形成的尚不清楚。由于環(huán)狀DNA能夠通過滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）的方式進(jìn)行復(fù)制，因而能夠產(chǎn)生大量的rRNA基因。

為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。在自然條件下，是通過從染色體切除基因的重復(fù)序列再在質(zhì)粒中進(jìn)行染色體外復(fù)制或通過將核糖體RNA的全部重復(fù)序列生成RNA轉(zhuǎn)錄物再轉(zhuǎn)錄生成原來DNA分子的額外拷貝而實(shí)現(xiàn)的。在實(shí)驗(yàn)室已建立了不等交換、從裂解細(xì)胞提取DNA或經(jīng)過滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）生成染色體外序列進(jìn)行人工。例如，在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中原有rRNA基因（rDNA）約200個(gè)拷貝，在減數(shù)分裂Ⅰ的粗線期，這個(gè)基因開始迅速復(fù)制，到雙線期它的拷貝數(shù)約為200萬個(gè)，擴(kuò)增近4000倍，可用于合成10的12次方個(gè)核糖體，以滿足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白質(zhì)的需要。在果蠅中也發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)象。在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細(xì)胞中產(chǎn)生卵殼蛋白的基因被擴(kuò)增。果蠅中的卵原細(xì)胞，經(jīng)4次分裂產(chǎn)生16個(gè)細(xì)胞，其中一個(gè)是卵母細(xì)胞（oocyte），將發(fā)育成為卵細(xì)胞，其他15個(gè)是營養(yǎng)細(xì)胞（nursecell），它們?yōu)槁鸭?xì)胞的形成提供大量的蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)，營養(yǎng)細(xì)胞之所以能夠產(chǎn)生大量的營養(yǎng)物質(zhì)，是因?yàn)樗鼈冊谛纬傻倪^程中發(fā)生了多次特殊的DNA復(fù)制，卵殼蛋白等基因拷貝數(shù)顯著增加。

-實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 
1、概述

實(shí)驗(yàn)室
臨床實(shí)驗(yàn)又稱PCR實(shí)驗(yàn)，是專門用來檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗(yàn)難以檢測出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實(shí)驗(yàn)需要有能保證安全、配置合理的實(shí)驗(yàn)室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)越來越得到重視，因?yàn)樗鼘z測結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本文主要從臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的平面布局，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制和污染的防制幾個(gè)方面對實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中的主要特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。因此，實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞這個(gè)核心問題進(jìn)行的。下面就對這幾個(gè)方面分別進(jìn)說明。
2、PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局
臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。

3實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制
PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。
3.1試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。

3.2標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時(shí)cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。

3.3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中，通常在*輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。

3.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。本區(qū)是zui主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。

4污染的預(yù)防與控制
PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

4.1工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分
（1）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；
（2）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

4.2合理的系統(tǒng)設(shè)置
（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；
（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

4.3規(guī)范的操作
（1）臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床檢驗(yàn)的工作；
（2）在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；
（3）清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。

4.4嚴(yán)格的管理
（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；
（2）在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服（如不同顏色），當(dāng)工作人員離開時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；
（3）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。
（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是zui主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；
（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

4.5完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施
完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機(jī)、加樣器等。

-PCR技術(shù) 
實(shí)驗(yàn)原理

PCR基本原理示意圖
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴(kuò)增的DNApian段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。
1．變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2．退火：使溶液溫度降至50－60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段。
3．延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106-109倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱Tag聚合酶。
實(shí)驗(yàn)儀器
1.PCR熱循環(huán)儀 2.移液器（0.1-2.5μL）3.PCR板
實(shí)驗(yàn)試劑
1．10×緩沖液：500mmol/LKCI、100mmol/LTriS·HCI（pH8.3，室溫）、15mmol/LMgCl2
2.dNTPMix：2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP
3.Tag酶5U/μL：
4.DNA模板1ng／μL：
5.引物1
6.引物2
7.引物溶液濃度2uM

實(shí)驗(yàn)步驟
1．在200ulEppendorf管內(nèi)配制20ul反應(yīng)體系
2．按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增
94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min30s30cycle；72℃延伸4min；4℃pause

注意事項(xiàng)
1．引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；
2．PCR反應(yīng)的各種成份不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；
3．根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；
4．注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

-研究進(jìn)展 
PCR實(shí)驗(yàn)
智能型PCR裝置在京研制成功。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的離體技術(shù)對基因工程的研究和應(yīng)用產(chǎn)生了革命性影響。提供自動(dòng)化的PCR儀器則是推廣PCR技術(shù)的關(guān)鍵。為解決國產(chǎn)PCR裝置的更新?lián)Q代并替代大量進(jìn)口，中科院發(fā)育生物學(xué)所zui近完成了以智能化儀表控制系統(tǒng)為核心的干式PCR裝置，經(jīng)多種對照引物和模板DNA的PCR實(shí)驗(yàn)，獲*成功，即將通過技術(shù)鑒定并批量生產(chǎn)。該儀器的研制成功為分子生物學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)鑒定及考古、環(huán)衛(wèi)等研究和應(yīng)用部門掌握和應(yīng)用PCR技術(shù)提供了高性能價(jià)格比的新裝備。該P(yáng)CR裝置采用人機(jī)對話操作方式，利用單片機(jī)小型專家系統(tǒng)，以豐富的智能化軟件取代了常規(guī)儀器的大部分硬件功能，使整機(jī)結(jié)構(gòu)大大簡化，操作方便.工作可靠，性能精良。其別具特色的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)運(yùn)行狀態(tài)顯示、自動(dòng)整定*PID參數(shù)、傳感器偏差補(bǔ)償、九組九步任意曲線串接編程、確保曲線平臺和伺服起動(dòng)、多種可預(yù)設(shè)上電方式、掉電保護(hù)及報(bào)警等硬件軟化功能充分顯示了智能化儀表技術(shù)的*性。為已有的國內(nèi)外PCR裝置。
HBVC區(qū)與PCR條件的優(yōu)化
目的：為提高PCR檢測乙型肝炎病毒（HBV）的特異性和靈敏度，降低成本，對PCR條件進(jìn)行優(yōu)化。方法：將HBV特異性基因片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒，利用PCR擴(kuò)增HBVC區(qū)基因，對PCR條件中的退火溫度、Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，并比較3種不同TaqDNA聚合酶的靈敏度。結(jié)果：HBVC區(qū)的*退火溫度為58℃,*Mg2+濃度為1.5mmol/L，BiostarTaqDNA聚合酶擴(kuò)增到10-6。討論：對HBVC區(qū)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)化和PCR實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，為擴(kuò)大PCR在乙型肝炎病毒（HBV）檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。