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抗原的濃縮

更新時(shí)間:2011-07-22   點(diǎn)擊次數(shù):1539次

濃縮是低濃度溶液通過(guò)除去溶劑(包括水)變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^(guò)程,在制備生物大分子及各種生化產(chǎn)品時(shí),常在提取后和結(jié)晶前進(jìn)行濃縮,有時(shí)也貫穿在整個(gè)制備過(guò)程中。沉淀(包括鹽析和有機(jī)溶劑沉淀),廣義上來(lái)說(shuō)也是一種濃縮方法,經(jīng)過(guò)沉淀再溶解,濃度可大大提高,但有時(shí)提取液很稀,體積又很大或結(jié)晶前除去少量溶劑,則常用其他方法濃縮。
  1.蒸發(fā)法 液體在任何溫度下都在蒸發(fā),蒸發(fā)是溶液表面的溶劑分子獲得動(dòng)能脫離液面逸向空間的過(guò)程。當(dāng)溶液受熱,液體中溶劑分子動(dòng)能增加,蒸發(fā)過(guò)程加快。蒸發(fā)的快慢和溫度、蒸發(fā)面積、液體表面積、液面蒸汽分子密度,即蒸汽壓大小有關(guān)。各種液體在一定溫度下都具有一定飽和蒸氣壓,當(dāng)液面上的溶劑蒸氣分子密度很小,經(jīng)常處于不飽和的低壓狀態(tài),液相與氣相的溶劑分子為了維持其分子密度的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),溶液中的溶劑分子就必須不斷地氣化逸出空間,以維持其一定的飽和蒸氣壓力。因此,根據(jù)上述原理,蒸氣濃縮裝置常按照加熱、擴(kuò)大液體表面積、低壓和加速空氣流動(dòng)等因素而設(shè)計(jì)的。
  2.冰凍法 冰凍法也是生物大分子及其他有機(jī)化合物濃縮的一種有效方法。生物大分子在冰凍時(shí),水分結(jié)成凍,鹽類(lèi)及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中。操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然后緩慢地融解,利用溶劑與溶質(zhì)融解點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液,用此法濃縮時(shí),不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面,蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。
  吸收法  是一種通過(guò)吸收劑直接吸收溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。使用的吸收劑必須與溶液不起化學(xué)反應(yīng),對(duì)生物大分子不起吸附作用,易與溶液分開(kāi),吸收劑除去溶劑后能重復(fù)使用。實(shí)驗(yàn)室中zui常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝膠等。使用凝膠時(shí),首先選擇凝膠粒度大小恰好溶劑及低分子物質(zhì)能滲入凝膠內(nèi),而生物大分子卻*排除于凝膠之外的,然后將洗凈和干燥的凝膠直接投入待濃縮的稀溶液中,凝膠親水性強(qiáng),在水中溶脹時(shí),溶劑及小分子被吸收到凝膠內(nèi),生物大分子留下剩余的溶液中,離心或過(guò)濾除去凝膠顆粒,即得已濃縮的生物大分子溶液。凝膠溶脹時(shí)吸收水分及小分子物質(zhì)可同時(shí)起到濃縮及分離純化兩種作用,對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)和生物活性都沒(méi)有影響。是近年來(lái)生物化學(xué)及分子生物學(xué)日益廣泛使用的濃縮和分離方法之一。
  使用聚乙二醇等其他吸收劑時(shí),需先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里,扎緊袋口,外加聚乙二醇復(fù)蓋,袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被溶劑飽和后,可更換新的,直到濃縮至所需的濃度為止。用完一次以后的聚乙二醇經(jīng)過(guò)加熱除去溶劑便可再次使用。
  4.超濾法 超濾法是使用一種特制的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的方法。當(dāng)溶液在一定壓力下(外源氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^(guò)膜時(shí),溶液和小分子透過(guò),大分子受阻保留于原來(lái)溶液中,其原理如圖2—2所示。這一近年發(fā)展起來(lái)的新方法是適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽,并具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持生物大分子生理活性、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。除去濃縮、脫鹽外,并可應(yīng)用生物大分子的分離純化,是目前民展較快且為人們所采用的生化技術(shù)之一。
圖2-2 超濾法示意圖
  通過(guò)超濾法,蛋白質(zhì)和酶的稀溶液一般可濃縮到10%~15%濃度,回收率高達(dá)90%。超濾法應(yīng)用關(guān)鍵在于膜選擇。不同類(lèi)型的規(guī)格的膜、水的流速(在規(guī)定壓力下以ml/cm2/h或分表示)、分子量截止值(即大體上能被膜保留分子zui小分子量數(shù)值)等參數(shù)均不同,必須根據(jù)工作的需要來(lái)選用。此外,超濾裝置形式、溶質(zhì)成分及性質(zhì)、溶液濃度及粘度都對(duì)超濾的效果有一定影響。
  制品濃縮到一定程度,即可貯存,如有必要可采用低溫干燥(冰干)的方法除去制品中溶劑,使之成干粉。
  制品的貯存可分干態(tài)貯存和液狀貯存。但不論是何種方法貯存,都要避免長(zhǎng)期暴露在空氣中,防止微生物的污染。溫度對(duì)生物活性物質(zhì)的活性影響很大,在絕大多數(shù)情況下應(yīng)采取低溫保存。
  干態(tài)儲(chǔ)藏:干燥的制品一般比較穩(wěn)定,如制品含水量很低,在低溫情況下,生物大分子活性可在數(shù)個(gè)月甚至數(shù)年沒(méi)有顯著變化。儲(chǔ)藏方法也很簡(jiǎn)單,只將干燥后的樣品置于干燥器內(nèi)(內(nèi)裝有干燥劑)密封,保持0~4℃冰箱中即可。有時(shí)為了取樣方便和避免取樣時(shí)樣品吸水和污染,可先將樣品分裝成許多小瓶中,每次用時(shí),只取一小瓶。
  液態(tài)儲(chǔ)藏:液態(tài)儲(chǔ)藏的優(yōu)點(diǎn)是使樣品減去干燥這一步驟,生物大分子的生理活性和結(jié)構(gòu)破壞較少,缺點(diǎn)是需要較嚴(yán)格的防腐措施,儲(chǔ)藏時(shí)間不能太長(zhǎng)。如樣品量大時(shí)封裝運(yùn)輸不方便,實(shí)驗(yàn)室常采取少量安瓿封存方法。液態(tài)儲(chǔ)藏注意事項(xiàng)如下:
  樣品不能太稀,必須濃縮至一定濃度后才能封裝儲(chǔ)藏,樣品太稀時(shí)容易引起生物大分子變性作用。
  一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑,常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有蔗糖、甘油等,如酶也加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性,此外鈣、鋅、硼酸等鹽溶液對(duì)某些酶也具有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。
  儲(chǔ)藏溫度要求較低,大多數(shù)在0℃左右冰箱保存即可,有的則要求更低溫度。但注意某些具有活性的大分子如DNA溶液低溫保存時(shí),有宜使溶液結(jié)冰以造成其分子結(jié)構(gòu)被破壞,另也有文獻(xiàn)報(bào)道某些蛋白質(zhì)和酶在低溫中反而引起變性。故應(yīng)分別情況對(duì)待,不能一概而論。
  生物大分子和各種生化制品的儲(chǔ)藏和保存,總的來(lái)說(shuō),溫度和水分是影響穩(wěn)定性的兩個(gè)重要因素,其次是各種穩(wěn)定劑的應(yīng)用是否適當(dāng)關(guān)系也很大。實(shí)際應(yīng)用時(shí),必須對(duì)各方面都加以考慮。
  所提取、純化的抗原物質(zhì),在使用前應(yīng)進(jìn)行定量測(cè)定。定量測(cè)定的方法,可根據(jù)不同的物質(zhì),選擇合適的方法進(jìn)行。
  某些分子量較小的抗原,如肽類(lèi)半抗原,由于其結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單,目前已有化學(xué)合成的純品供應(yīng),不必自己去從組織中提取?;瘜W(xué)合成是一項(xiàng)專(zhuān)門(mén)技術(shù),可參閱有關(guān)書(shū)籍。