YIJI細胞CDK2/CYCLIN E激酶活性光譜法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細胞CDK2/CYCLIN E激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在CDK2/CYCLIN A抑制劑的存在下，受到CDK2/CYCLIN E磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中CDK2/CYCLIN E特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中CDK2/CYCLIN E激酶的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

細胞周期素依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2；CDK2；EC 2.7.11.22），又稱為細胞分裂周期蛋白1（cell division cycle1；CDC1）或p33，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其與酵母細胞的cdc28和cdc2高度進化保留。細胞周期素依賴性激酶2的催化亞體，與細胞周期素E結(jié)合，允許細胞由G1期過渡到DNA合成期，達到調(diào)節(jié)細胞生長、DNA復制、細胞分裂等。p21Cip1 （CDKN1A）and p27Kip1 （CDKN1B）是CDK2激酶的抑制劑。CDK2/CYCLIN E激酶的磷酸化目標序列為HHASPRK。基于底物HHASPRK，在ATP和CDK2/CYCLIN A抑制劑NU6102的存在下，受到CDK2/CYCLIN E激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析細胞周期素依賴性激酶2/細胞周期素E的特異活性。其反應方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反應液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）   微升

YIJI陰性液（Reagent G）  微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

CDK2/CYCLIN E激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

比色皿或96孔板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光譜分析

實驗步驟

• 待測樣品準備

• 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 106細胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

• 樣品測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

• 計算樣品活性

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

七、抑制劑篩選

• 在96孔板上做好相應標記：背景、*活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進行樣品預處理

• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 即刻放進30℃酶標儀檢測：測讀30分鐘
• 抑制活性計算：

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加入樣品啟動反應后3秒內(nèi)即刻光譜測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘
• 光譜測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1） 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用CDK2/CYCLIN E抑制劑二氨基吡唑-1氫4-基偶氮酚【4-（3,5-diamiH-pyrazol-4-ylazo）-phenol】作為抑制劑對照或陰性對照
• CDK2/CYCLIN E激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

試劑盒訂購信息