細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒（Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit）
提供了一種簡單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提核蛋白與漿蛋白的方法。約
90 分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的核蛋白與漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白為非變性，
有活性，可以用于Western、EMSA、footprinting、報告基因檢測以及酶活力測定等
后續(xù)操作。本試劑盒是通過細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A 和B，在低滲透壓條件下，使細(xì)
胞充分膨脹后破壞細(xì)胞膜，釋放出漿蛋白，然后通過離心得到細(xì)胞核沉淀。zui后通
過高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到核蛋白。本試劑盒可以抽提50 個，數(shù)量為
2×106 個Hela 細(xì)胞（約40mg）的樣品。可根據(jù)需要按比例放大，縮小提取規(guī)模。
Elisa試劑盒 11:21:57
v 注意事項：
1. 需自備PMSF， PMSF 一定要在抽提試劑加入到樣品前2-3 分鐘內(nèi)加入，以免
3. 對于組織樣品，本試劑盒僅適合于新鮮組織，對凍存過的組織抽提效果差?？?/a>
4. 使用本試劑盒抽提得到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白都可以直接用博邁德生產(chǎn)的
BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。但不適合用Bradford 法測定蛋白濃度。
Elisa試劑盒 11:22:56
v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)
量的CER A 備用，在需要加入前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF 至終濃度為1mM。取適當(dāng)量
的NER 備用，在需要加入前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF 至終濃度為1mM。如果目標(biāo)蛋白
含豐富的半胱氨酸，可在CER A、NER 中加入DTT 至終濃度0.5mM。
1. 對于貼壁細(xì)胞：用PBS 洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA 溶液處理細(xì)胞
使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打細(xì)胞（不用胰酶消化，因為可能降解蛋
白）。500×g 離心2-3 分鐘，盡可能吸棄上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用
胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。接步驟4。
2. 對于懸浮細(xì)胞：用PBS 洗一遍，500xg 離心2-3 分鐘，盡可能吸棄上清，留下細(xì)
1） 把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。在PBS 里面勻漿制成細(xì)胞懸液，500xg 離心
2） 把組織稱重后，把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片，按照每50 毫克組織加入500
微升的比例加入CER A，勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，接步驟5。在步
驟7 按照每200 微升CER A 加11 微升比例加入CER B。
4. 每20 微升細(xì)胞沉淀加入200 微升添加了PMSF 的CER A。（對于2×106 個Hela 細(xì)
胞，其細(xì)胞沉淀的體積大約為20 微升或40 毫克。）
5. zui高速劇烈Vortex 15 秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。（如果細(xì)胞沉淀沒有完
全懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長Vortex 時間。）
7. 加入CER B 11 微升。zui高速劇烈Vortex 5 秒，冰浴1 分鐘。
8. zui高速劇烈Vortex 5 秒，4℃ 14,000-16,000g 離心5 分鐘。
9. 立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。可以立即使用，
也可以凍存。（千萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸
10. 對于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50 微升添加了PMSF 的NER。（不吸盡上
11. zui高速劇烈Vortex 15-30 秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中，
每隔10 分鐘再高速劇烈Vortex 15－30 秒，共40 分鐘。
Cytoplasmic Extraction Reagent A（CER A） 4°C. 10ml
Cytoplasmic Extraction Reagent B（CER B） 4°C. 0.55ml
Nuclear Extraction Reagent （NER） 4°C. 2.5ml
12. 4℃ 14,000－16,000xg 離心10 分鐘。
13. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？梢粤⒓词褂茫?/a>
也可以-70℃凍存。
Elisa試劑盒 11:23:54
v 問題與解決方法
不*細(xì)胞核分離-建議：加入CER B 后，加大離心時間
抽提試劑和細(xì)胞團的體積比例不適和-建議：按照20 微升細(xì)胞
蛋白酶活性偏高-建議：除了PMSF，可加入多種protease inhibitor
細(xì)胞漿抽提物（胞漿蛋白）未*清除-建議：細(xì)胞核抽提前，
勻漿過度，不足或者不均勻-建議：優(yōu)化勻漿時間和條件
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