組織培養(yǎng)細(xì)胞的裂解
更新時(shí)間：2024-05-09 點(diǎn)擊次數(shù)：210次
對于組織培養(yǎng)中生長的細(xì)胞，zui有效的裂解方法是用去污劑進(jìn)行處理。雖然有多種去污劑可用于裂解細(xì)胞，但zui常用的是TritonX—100或NP—40等非離子型去污劑。非離子型去污劑能溶解胞質(zhì)和細(xì)胞膜，破壞分子間許多微弱的結(jié)合鍵，并能溶解大部分經(jīng)常研究的蛋白質(zhì)抗原，但對于大分子多聚抗原則無效，在大多數(shù)情況下該抗原也是難以研究的。濃度介于0．1％～1％的去污劑即可滿足幾乎所有溶解需求。非離子型去污劑裂解液一般補(bǔ)充等離子濃度的鹽和接近中性的pH。
在某些情況下，需要較劇烈的抽提條件以釋出所研究的抗原或除去微弱的相關(guān)蛋白。此時(shí)，推薦使用RIPA裂解緩沖液，該體系含離子型和非離子型去污劑，具有相當(dāng)大的變性能力。除細(xì)胞內(nèi)不溶性蛋白外所有可溶性蛋白分子均可釋出，并能破壞大部分非共價(jià)的相互作用。
除非有特殊原因，推薦在裂解緩沖體系中加入蛋白酶抑制劑混合液。在新抗原研究的早期使用蛋白酶抑制劑總是有利的。在該蛋白已被定性后，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以了解這些抑制劑是否在所有情況下都必需。如前所述，終止蛋白酶作用的方法是在免疫沉淀的全部過程中溶液保持低溫。
如果研究經(jīng)磷酸化修飾的蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)考慮加入磷酸酶抑制劑。
1．準(zhǔn)備工作
由于免疫沉淀有多個(gè)步驟，且包括數(shù)小時(shí)孵育，因此在實(shí)驗(yàn)開始前必須安排好時(shí)間，注意適當(dāng)利用過夜孵育的時(shí)間間隔。這將有助于決定何時(shí)開始裂解細(xì)胞。
2．所需溶液
PBS，裂解緩沖液（4℃預(yù)冷）。
3．操作步驟
（1）單層細(xì)胞的培養(yǎng)，用室溫PBS洗細(xì)胞一次，然后甩干；懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，400g離心10min，收集細(xì)胞棄上清液。
（2）對于單層細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶置于冰上，每lOOmm培養(yǎng)瓶加入1 mL溶解緩沖液（4℃預(yù)冷）；對于懸浮培養(yǎng)，將盛細(xì)胞團(tuán)的試管置于冰上。按107個(gè)細(xì)胞加入1．0ml裂解液（4℃預(yù)冷）。
保存在冰箱的裂解液可隨時(shí)使用。
（3）冰上放置3min，不時(shí)敲擊貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶，或輕搖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
（4）對于單層細(xì)胞培養(yǎng)，敲擊培養(yǎng)瓶數(shù)次，混合均勻，在冰床上傾斜培養(yǎng)瓶使溶液集中于一側(cè)，然后將裂解物移置另一支1．5mL圓錐形試管。有些研究者喜歡從瓶壁刮取細(xì)胞，但除特殊要求外此舉并非必須。
（5）單層培養(yǎng)的細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞均以10 000g，413離心10min，仔細(xì)吸取上清液盛于另一試管，不可攪動(dòng)細(xì)胞團(tuán)。置冰上。
此時(shí)，上清液可用于下一步的預(yù)處理。
4．常見問題
上述程序zui普遍的問題是抗原不*從細(xì)胞內(nèi)釋放?？梢酝ㄟ^對裂解液和細(xì)胞殘?jiān)M(jìn)行免疫印跡來檢查抗原是否*釋放。改變裂解液所用的去污劑是增加抗原釋放的zui有效方法。
機(jī)械性剪切也可破壞細(xì)胞膜，常見的方法包括使用超聲波發(fā)生器、Dounce勻漿器、波特器和攪拌器等。這些方法特別適用于大體積制備或需避免使用去污劑時(shí)。在這些方法中，zui溫和的方法是使用Dounce勻漿器，但僅適合于較大體積的標(biāo)本（數(shù)毫升或更多）。
一般不推薦凍融法，因反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)過量降解，其原因不明。除非所研究的抗原特別能耐受蛋白水解作用或者事先已測試過該方法，一般不作為。通常，用去污劑裂解是免疫沉淀的方法。
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